Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Aspiration von Knochenmark von Patienten nach Hüft- und Kniegelenk

Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Aspiration von Knochenmark von Patienten nach Hüft- und Kniegelenk

Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Aspiration von Knochenmark von Patienten nach Hüft- und Kniegelenk

Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Aspiration von Knochenmark von Patienten nach Hüft- und Kniegelenkersatz zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen und in vitro Chondrogenese

1 Arthritis Programm, Orthopädische Chirurgie, Toronto Western Hospital, 399 Bathurst Street, Toronto, ON, Kanada M5T 2S8
2 Institut für Biomaterialien und Biomedizinische Technik, Universität von Toronto, 164 College Street, Toronto, ON, Canada M5S 3G9
3 Krembil Research Institute, University Health Netzwerk 399 Bathurst Street, Toronto, ON, Kanada M5T 2S8
4 STTARR Innovationszentrum, Prinzessin Margaret Cancer Center, University Health Netzwerk 101 College Street, Toronto, ON, Kanada M5G 1L7

Akademische Herausgeber: Robert B. Levy

Copyright © 2016 Subhash C. Juneja et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel unter der Lizenz Creative Commons. sterben es Erlaubt sterben uneingeschränkte nutzung, Gewinnung: und Vervielfältigung in Jedem Medium, sofern sterben ursprüngliche Arbeit richtig zitiert Werd.

abstrakt

1. Einleitung

Die Hinteren Beckenkamm ist eine leicht zugängliche Stelle für die Aspiration des Knochenmarks sterben sicher ist und psychologisch weniger traumatische und liefert Proben von Knochenmark Repräsentative ähnlich der vom Brustbein erhalten, der Wirbelsäule und der Vorderen Beckenkamm [1]. Diagnostizieren, In der Regel für Biopsie und sterben klinische sterben sammeln Kliniker Knochenmark von Hinteren und Vorderen Beckenkamm und Lendenwirbel Stiels. Für Osteoarthritis Forschung und Entwicklung für von Biotechnik-Werkzeuge für OA oder verwendung in anderen Krankheiten zu reparieren, Kanns Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen von Patienten TKA oder THA aspiriert Werden unterziehen und Kanns Eine Alternative und Wirtschaftliche Quelle Sterben für mesenchymale Stammzellen (MSCs) sein. Es gibt Berichte von Forschern Knochenmark von Patienten für sterben Forschung aspiriert verwendung obwohl Protokolldetails nie [2 veröffentlicht. 3 ]. Knochenmarksaspiration Elle Elle Verfahren von Patienten Können von Chirurgen zu Chirurgen variieren. Am Anfang Chirurgen in Unserem oder versuchten, Knochenmark von Patienten MIT Oberschenkel Einer Pipette absaugen und das führte zu Gerinnung von Knochenmark. Durch dieses Einfache Elle Elle Verfahren der Einführung Wird das Knochenmark direkt in sterben Probenfalle angesaugt und Werd mit Antikoagulans sofort Unter dem einfluss von Vakuum gemischt, war zu minimalen oder Keinen Gerinnung von Knochenmark. Zweitens stellen wir ein einfaches Laborverfahren für MSCs und Details zur Protokoll Erzeugung einge Einge von Mikromassen Knorpeln zu isolieren, sterben für Osteoarthritis Forschung und Reparatur Werden Kann verwendet. Soweit wir wissen, stirbt ist erste detaillierte Bericht für ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Knochenmark abgesaugt der.

2. Materialien und Methoden

2.1. Aspiration von Knochenmark von Patienten, Total Knee oder Hüftendoprothetik (TKA oder THA)

Abbildung 1: Knochenmarksaspiration, mononukleären Zellen (MNC) Trennung und MSCs in Zellkultur gezüchtet (a-e). Eine Probe FALLE für sterben Sammlung von Knochenmark verwendet Werd (a). Ein orthopädischer Chirurg absaugen des Knochenmarks aus dem Femur Eines Patienten, der Einer THA (b). Der Chirurg Probenfalle nach Aspiration von Knochenmark zeigt (c) sterben. Eine OP-Schwester sterben Vollständige Ansicht des Probenfalle zusammen mit der Saugnadel und DM gesammelten Knochenmark (d) zeigt. Ein Flussdiagramm, das das Elle Elle Verfahren von MNU Trennung Von dem Knochenmark und sterben Einrichtung von MSCs in Zellkultur (e) zeigt. Ein Graph präsentiert Rückgewinnung von einkernigen Zellen (MNC) pro ml aspiriert Knochenmark von proximalen und distalen Femur von den Patienten THA und TKA unterziehen, BZW. (Verbindungen); Eine Kurve, sterben Anzahl der lebensfähigen MSCs (expandiertes bis Durchgang 3) pro ml Knochenmark aspiriert von proximalen und distalen Femur von den Patienten, THA und TKA, BZW. sterben (Rechts) (f) darstellt; ein Diagramm, das Volumen des Knochenmarks Von dem proximalen und distalen Femur von den Patienten zum Begünstigte der MNU Begünstigte Zwecke Trennung (g) unterzogen und THA TKA erholt präsentiert.

2.2. Isolierung von MSCs aus dem Knochenmark aspirieren

Die Anzahl der Knochenmarkproben von Patienten unterziehen aspiriert THA und TKA Betrug 28 BZW. 10. Die Männlichen und Weiblichen Verhaltnis Krieg 1. 1 In jeder Gruppe. Eine Durchschnittliche Anzahl von Lebenden MNC pro ml Knochenmark gerechnet gerechnet wurden

to) vom proximalen und distalen Femur von Patienten THA und TKA BZW. (Abbildung 1 (f)) unterzogen. Es gab bei der Gewinnung von Keinen Unterschied multinationalen Unternehmen aus dem Knochenmark von Diesen Zwei Stellen abgesaugt signifikanten (

). Durchschnittsalter der Patienten, der Einer THA und TKA Krieg (Bereich: 51-63) und (Bereich: 51-64) JAHREN (). Sehr interessant ist, war das Volumen des Knochenmarks Von dem proximalen Femur aspiriert 2,29-fach Höher als vom distalen Femur (ml pro Aspiration Gegenüber,

; Figur 1 (g)). Die erweiterten Anzahl lebensfähiger MSCs pro ml Knochenmark bei Passage 3, Von dem proximalen und distalen Femur (am Tag im Vergleich zu in proximale und distale Femur, resp.). [(Bereich: 0 bis) im Vergleich zu (Bereich: 0 bis)], tat nicht voneinander unterscheiden (Abbildung 1 (f)).

2.3. Charakterisierung von MSCs Durch Immunzytochemie (ICC)
2.4. Durchflusszytometrie

(Maus-PE-Cy 7 anti-human CD19, Cat. 557.835, BD Pharmingen); CD73-APC (APC Maus anti-human CD73, Katze 560847, BD Pharmingen.); CD146-PE (PE Maus anti-human CD146, Cat 550.315, BD Pharmingen.); CD14-PE (PE Maus Anti-Human-antikörper C14, Cat 301.805, BioLegend.); CD90-APC (APC Maus Anti-Human-CD90, Klon 5E10 (RUO), Kat. 559869, BD Biosciences). Antikörperfärbung Wurde bei 4 ° C in PBS, enthaltend 5% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS) durchgeführt. Ungefähr 50.000-100.000 Zellen gerechnet gerechnet wurden pro Vertiefung gefärbt. Zellen gerechnet gerechnet wurden unter verwendung EINES LSR II Durchflusszytometer (Becton Dickinson) erworben. Die Analyse unter verwendung von FlowJo (Baum Stern) durchgeführt Würde.

2.5. Charakterisierung von MSCs Durch Differenzierungsassays

Differenzierungsassays gerechnet gerechnet wurden mit MSCs Proben von 4 Spendern Wiederholt und repräsentative ergebnisse Werden Vorgestellt. Chondrogenese Wurde genauer untersucht.

2.5.1. Adipogenese

Adipogenese von MSCs Wurde unter verwendung Eines Kits (A10070-01, STEMPRO®, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, gerechnet gerechnet wurden MSCs (38000) beimpft pro Vertiefung in Eine 12-Well-Zellkulturplatte (3513, Costar®, CORNING) bei Einer Dichte von Zellen / cm 2 in MSCs Medium bei 37 ° C in befeuchteten Einer Atmosphäre bei 5% CO2. Nach 3 h gerechnet gerechnet wurden die Medien Mit vorgewärmtem Adipogenese Differenzierungsmedium und Inkubation fortgesetzt (Tag 0) Ersetzt. MSCs fortgesetzt Begrenzte Expansion zu unterziehen, Wie sie unter adipogenetische bedingungen unterschieden. Adipogenetische Medium Würde alle 3 Tage Ersetzt. Am Tag 9 gerechnet gerechnet wurden sterben Zellen mit Oil Red O und photographiert gefärbt.

2.5.2. Osteogenesis

Osteogenesis von MSCs Wurde unter verwendung Eines Kits (A10072-01, STEMPRO, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, im Anschluss ein Anweisungen des Herstellers sterben. Kurz gesagt, gerechnet gerechnet wurden pro Vertiefung MSCs (19000) beimpft in Eine 12-Well-Zellkulturplatte in Einer Dichte von Zellen / cm 2 in MSCs Medium bei 37 ° C in befeuchteten Einer Atmosphäre bei 5% CO2. Nach 3 h gerechnet gerechnet wurden die Medien mit vorgewärmtem Vollständige Osteogenese Differenzierungsmedium und Inkubation fortgesetzt (Tag 0) Ersetzt. MSCs fortgesetzt Begrenzte Expansion zu unterziehen, Wie sie unter osteogenen bedingungen unterschieden. Die Medien gerechnet gerechnet wurden alle 3 Tage Ersetzt. Am Tag 20 gerechnet gerechnet wurden Zellen mit Alizarin Rot S und photographiert gefärbt sterben.

Alizarin Red S-Färbung. Für Osteogenese ist Ablagerung von Calciumphosphat ein Anzeichen für MSCs Differenzierung zu Osteoblasten und DAMIT sterben in vitro Knochenbildung. Medium in den Zellkulturvertiefungen Würde Entfernt; Zellen gerechnet gerechnet wurden MIT Ca ++ gewaschen -Mg ++ -freiem D-PBS und Dann in 2 ml 10% NBF (40 min) festgelegt. Die Zellen gerechnet gerechnet wurden mit dH gewaschen2 O, gefärbt mit Alizarin Rot S (2%, pH-Wert 4,3; A5533, Sigma-Aldrich, 2-3 min) und gewaschen Mit dH2O (3x). Gefärbte Zellen gerechnet gerechnet wurden fotografiert, während immer noch unter Wasser zu sein Zeiss-V8-Entdeckung Stereomikroskop verwendet Wird.

2.5.3. Chondrogenese

Für Chondrogenese Assays gerechnet gerechnet wurden Mikromassenkulturen etabliert. Zellen gerechnet gerechnet wurden in Einems Gesamtvolumen von 30 beimpft μ L Auf einem Trockenen Flachboden-24-Well-Platte (3526, Costar 24-Well Klar TC-behandelten Multiple Well-Platten) Mit Einer Dichte von

Tabelle 1: Die Rekonstitution von unvollständigen Chondrogenese Medium.

(2) Massons Trichromfärbung. Folien mit Paraffingewebeschnitte gerechnet gerechnet wurden für 60 min bei 58-60 ° C erhitzt. Tissue Paraffinschnitte gerechnet gerechnet wurden entparaffiniert und hydratisiert, wie früher in DM Text beschrieben. Sterben in Objektträger vorgewärmten 0,2% Chromsäure 60 bei ° C (5 min) gerechnet gerechnet wurden, gespült in Hahn H platziert2 O (5x), gebeizt in Weigert Eisenhämatoxylin (10 min), gewaschen in Hahn H2 O bis zur Blaufärbung laugt aus, differenziert in 1% Essigsäure (2x, 1 sec), in fließendem Wasser gewaschen H2 O (2 min), Behandelt mit 1% Biebricher Scharlach (AC402221000, Fisher Scientific, in Essigsäure) für 1 min, in fließendem Leitungswasser (2 min) gespült, Behandelt mit 5% Wolframatophosphorsäure / Phosphomolybdänsäure (A237-100, A248-500, Fisher Scientific) für 1 min, Behandelt in 1% lichtgrün grün ~~ POS = HEADCOMP SF (P399-03, JT Baker) und differenziert in 1% Essigsäure und in Leitungswasser gespült (5x). Die Schnitte gerechnet gerechnet wurden dehydriert in zunehmender KONZENTRATION von EtOH (70, 95 und 100%, 2 x 3 min) und gelöscht mit Histo-Clear II® (3x, 3 min). Die Objektträger gerechnet gerechnet wurden halbluftgetrocknet und montiert Omnimount mit Klebemittel. Wie der Name des des andeutet, verwendet, um dieses Färbung Selektiv Anfärbung Muskel, Kollagenfasern, Fibrin und Erythrozyten. Nuclei Farben schwarz, Zytoplasma, Muskel und Erythrozyten Fleck rot und Kollagen Flecken blau.

(3) Safranin-O-Färbung. Safranin-O-Färbung in Mikromasse Knorpeln lokalisiert Proteoglykane. Folien mit Paraffingewebeschnitte gerechnet gerechnet wurden für 60 min bei 58-60 ° C erhitzt. Paraffinschnitte bei RT gerechnet gerechnet wurden in Histo-Clear II (3x, 3 min, 64.111 bis 01, EM Sciences) und hydratisiert in abnehmender KONZENTRATION ein Ethanol [EtOH, 100%, 95%, 70% und 0% (dH entparaffiniert2 O), 2x, Jeweils 3 min] und schließlich in dH gelegt2 O. Die Schnitte gerechnet gerechnet wurden in Weigert Eisenhämatoxylin (5 min) und gespült in Änderungen von dH gefärbt2 O bis Auswaschung von Blaufärbung gestoppt. Sterben Schnitte in 1% Würden Säure-Alkohol (2 Sekunden), gespült in dH differenziert2 O (4 x), und MIT 0,02% Fast Green Behandelt (15 min), 1% Essigsäure (10 Sekunden), und 1% Safranin O (20800, EM Sciences) für 10 min. Die Schnitte gerechnet gerechnet wurden dehydriert in 95% EtOH (4x, 15 s) und 100% EtOH (4x, 15 Sekunden) und in Histo-Clear II (3x, 3 min) und montiert in Omnimount Eindeckmediums (17997, EM Sciences) gelöscht. Proteoglykane Fleck rot, Zytoplasma Flecken graugrün, und Kerne Farben schwarz. Knieparaffinschnitt (4 μ m dick) Aus einer Ratte für Safranin-O-Färbung als Eine positive Kontrolle Gefärbt Würde.

Tabelle 2: Liste der antikörper für IHC von Mikromassen Knorpeln verwendet.

3. ergebnisse

3.1. Knochenmarksaspirationen und MSCs Charakterisierung

Wir präsentierten ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für Aspiration von Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen von Patienten, sterben Sich TKA und THA (Abbildungen 1 (a) bis 1 (d)) sterben. Das Knochenmark Würde ohne Blutgerinnung oder mit minimaler Blutgerinnung in allen Bestrebungen sammelten wir Mit diesem Elle Elle Verfahren bisher durchgeführt. Des Weiteren Haben wir gezeigt, dass Fettmaterial war einfach in DM Ersten schritt der Zentrifugation zu entfernen, das Mark Bevor über Ficoll-Paque PLUS für Gradienten Bildung (Abbildung 1 (e)) wird geladen. Vorbei an der Knochenmark Durch weit gelochten Sieb erwies Sich als ein nützlicher schritt, da es JEDE Knochensporn oder Fasergewebe oder irgendwelche geronnenen Stücke von Knochenmark Entfernt, sterben wahrscheinlich auf Gradienten Trennung von mononukleären Zellen (MNC) stören. Soweit wir wissen, ist dies das Wadenfänger Kunst in Einems einfachen Protokoll-Formular, wir hier berichten sterben Erste. Das Volumen des Knochens vom Femur abgerufene Mark von Patient zu Patient Variiert (≈2-20 ml). Hier berichten wir MSCs Isolierung aus dem Knochenmark abgesaugt vom proximalen Femur von 28 THA Patienten (M. F: 1. 1) und distale Femur von 10 TKA-Patienten (M. F: 1. 1).

Figur 2: Immunzytochemie der Zelloberflächenmarker für den Menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSCs. Positive Markern (CD44, CD90, CD146 und STRO-1) und negativen Marken (CD19 und CD14) als In jeder Platte Westerwaldkreis.png dargestellt. CD44 ist grün gefärbt mit Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären antikörper, Wobei der Sekundär-antikörper für den Rast der Platten mit Cy3, konjugiert und zeigte Wurde rote Farbe in positive Marker oder Abwesenheit von roten Markierung in negativer Marker. Nuclei blau gefärbt mit DAPI in allen Platten.

Figur 3: Durchflusszytometrie von humanem Knochenmark abgeleitete MSCs Angabe der Prozentsatz Jeder Marker In jeder Platte und den Namen des konjugierten Antikörpers an der unterseite Jeder Platte. C73, CD105 und CD90 als positive Marker und CD34, CD45, CD19 und CD14 gezeigt als negativ Marker gezeigt.

Abbildung 4: Knochenmark abgeleiteten MSCs in Adipozyten differenzierenden (a) und Osteoblasten (b-d). Lipidtröpfchen Sind Sichtbar in Adipozyten (Pfeil a) und Mineralisierung: teilweise dunkel (ungefärbt, b) und Alizarin-Rot-gefärbten Hellfeld (c) und Phasenkontrast (d) Kalzium in Osteoblasten Entwickelt Einlagen.

Abbildung 5: Chondrogene Differenzierung von Knochenmark abgeleiteten MSCs und Erzeugung einge Einge von Mikromassen Knorpeln (a-c) sterben. Eine hohe Dichte von MSCs in 2 h zeigt MSCs Kondensation zu Beginn der Chondrogenese (a). Ein Micro Knorpel, in Einer Platte 24 Vertiefungen dargestellt MIT, in Woche 4 der Chondrogenese (b). Micro Knorpel, in den Wochen 1, 2, 3, und 4 zeigt Eine allmähliche Zunahme der Größe mit der Zeit (c).

3.2. Micro Chondrogenese und Bewertung

Masson Trichrom-Färbung zeigten, Dass Kollagen (blau gefärbten Fibrillen), interzellularen Abstand und Chondrozyten Größe von Woche erhöht 1 bis Woche 4 in Mikromasse Knorpeln (Abbildung 6 (a)). Safranin-O-Färbung sterben anwesenheit von Proteoglykanen in den Wochen 1 und 2 gezeigt, sterben in den Wochen 3 und 4 (Figur 6 (b)) Wurde reichlich. Ratte Knie diente als positive Kontrolle für sterben Safranin-O-Färbung, sterben Proteoglykane in Gelenkknorpel (Abbildung 6 (b)) gezeigt. COL II begann in Woche 2 und Würde prominent bei nachfolgenden Zeitpunkten (Wochen 3 und 4) in Mikromasse Knorpeln (Abbildung 7 (a)) ausgedrückt Werden. Ratte Knie Gelenkknorpel zusammen mit Meniskusknorpel und Menschlichen Trachealknorpels Diente als positive Färbung für COL II (Abbildung 7 (a)). Col II vorlag rund Chondrozyten und in interzellulären Matrix (Figur 7 (a)). COL ich bei allen Zeitpunkten in Mikromasse Knorpel (Woche 3 nicht gezeigt, 7 (b)) zum Ausdruck gebracht Wurde. Ratte Knie diente als positive Kontrolle für COL I, Dérens Expression nur in Knochenbälkchen gezeigt Wurde, und sterben nativen Knorpel Gelenkknorpel nicht ausdrücken COL I (Abbildung 7 (b)). Negative kontrollen Sind in Figur 7 (c) gezeigt. COL X zeigte Eine schwache Expression in den Wochen 3 und 4, und das ist ein Zeichen für niedrige Niveau der Hypertrophie von Chondrozyten (Abbildung 8 (a)). Hypertrophen Chondrozyten Zone in unentkalkte Schenkelabschnitt von P1 Maus Würde als positive Kontrolle (Abbildung 8 (a)) eingesetzt. Micro Knorpeln zeigten keine Apoptose (Abbildung 8 (b)). Maus Involution Brustdrüse (Tag 4 nach der Geburt) diente als positive Kontrolle für sterben Apoptose (Abbildung 8 (b)).

Abbildung 7: IHC von COL II (a) und COL I (b) in Mikromasse Knorpeln. COL II ausgedrückt in den Wochen 2-4 (a), und COL I ausgedrückt in den Wochen 1-4 (Woche 3 nicht gezeigt, b), in Mikromasse Knorpeln. Der Gelenkknorpel von Ratten Knie und Menschlichen Trachealknorpels Diente als positive Kontrolle für COL II; Höhere Vergrößerung von Mikromassen Knorpel Woche 4 zeigt, Dass es in ECM ist (a). COL I ist in nativen Gelenkknorpel in positive Kontrolle abwesend ist und in Knochen nur, während COL ich auf niedrigem Niveau in der biotechnischen Mikromassen Knorpel (b) zum Ausdruck kommt. Micro Knorpel- und Ratte Tibia zeigte keine Färbung bei primären antikörper fehlte und nur Maus-IgG-Krieg vorhanden, der als negativer Kontrolle diente (c). M, Meniskus; AC, Gelenkknorpel; B, Knochen; mm, Mikromasse.

Abbildung 8: IHC von COL X zeigt das Vorhandensein von Schwachen Signale in Woche 3 und Woche 4 Micromass- Knorpel (a), während Apoptose-Assays keine Apoptose in Mikromasse Knorpel (b) zeigen sterben. Maus entkalkten P1 Glied zeigte hypertrophen Chondrozyten Zone (Pfeile) als positive Kontrolle für COL X (a). Involution MG Maus (Brustdrüse) bei postpartalen Tag 4 zeigte apoptotischen Zellen in Brustepithel (Pfeil), sterben als positive Kontrolle diente, während keine apoptotischen Zelle in Woche 4 in Mikromasse Knorpel im Vergleich zu positiven Kontrolle gefunden Wurde. mm, Mikromasse.

Aggrecan und COL VI zeigte Expression in Mikromasse Knorpeln (Figuren 9 (a) und 9 (b)) sterben. Ratte Knie Gelenkknorpel diente als positive Kontrolle für Aggrecan (9 (a)). Menschliche Trachealknorpels Diente als positive Kontrolle für COL VI; Höhere Vergrößerung zeigt, sterben Dass COL VI bei perizellulärer Regionen von Chondrozyten oder Lakunen Enthält Chondrozyten (Abbildung 9 (b)) zentriert ist. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Mikromassen Knorpel aus dem Oberen Mittleren Bereich in Woche 4 gezeigt Sind (Figuren 10 (a) bis 10 (e)) und das zeigt ein, dass Chondrozyten Sind normal in Woche 4 des Micro Knorpels. Chondrozyten Erscheint mit umfangreichen Golgi Netzwerk metabolisch aktiv zu sein, gut entwickelte Rauhe endoplasmatische Retikulum (RER), Euchromatin Kern mit Nukleolus, Eine große Anzahl von sekretorischen Vesikeln und beschichtete Vesikel, Eine Reihe von Lipidtröpfchen, und Glykogen, Mitochondrien und Lysosomen. Centriole vorhanden ist. Extrazellulären Matrix (ECM) zeigt Kollagenfasern (10 (a) bis 10 (e)).

Abbildung 9: IHC zeigte, dass Mikromassen Knorpel Aggrecan und COL VI ein allen Zeitpunkten ausgedrückt (Wochen 1-4, a, b). Der Gelenkknorpel von Ratten Knie ausgedrückt Aggrecan und diente als positive Kontrolle (a). Menschliche Trachealknorpels Diente als positive Kontrolle für COL VI und zeigte die COL VI in Position im nativen Knorpel (b) perizellulärer ist. Eine stärkere Vergrößerung der Woche 4 biotechnologisch Micromass- Knorpel zeigt Auch sterben perizellulärer Lokalisierung von COL VI (Pfeilspitzen, b). Ratte Knie (a) und Micro Knorpels (b) gerechnet gerechnet wurden als Negativkontrolle mit Kaninchen-IgG polyklonalen und ohne primären antikörper verwendet. M, Meniskus; AC, Gelenkknorpel; B, Knochen; mm, Mikromasse.

Abbildung 10: TEM aus dem Oberen Mittleren Bereich von Mikromassen Knorpel in Woche 4 für normale Struktur von Chondrozyten in biotechnologisch Knorpel (a-e). Tafel (b) zeigt sterben Höhere Vergrößerung des Paneels (a). Chondrozyten Erscheinen metabolisch aktiv mit Umfangreiches Netzwerk von Golgi, gut entwickelte rER euchromatic sein mit Kern zu, anwesenheit in der Regel Mit der von Nukleolus, Einer Anzahl von sekretorischen Vesikeln und beschichtete Vesikel, Eine Reihe von Lipidtröpfchen, das Vorhandensein von Glykogen, Eine Reihe der Mitochondrien, und anwesenheit von Lysosomen sterben. Centriole ist gelegentlich Sichtbar. Die interzelluläre Regionen zeigen das Vorhandensein von Kollagenfasern und extrazellulären Matrix. Nucleus ist oval in der Form zu unregelmäßig (a, c-e). L: Lipidtröpfchen, eL: extrazellulären Lipidtröpfchen, M: Mitochondrium, rER: Rauen endoplasmatischen Retikulum, Ly: Lysosom, G: Golgi-Netzwerk, V: Vesikel, CV: beschichtete Vesikel, N: Kern, Nu: Kernkörperchen, Vac: Vakuole C : ECM Kollagenfasern und: Matrix extrazelluläre.

3.3. Statistische Analyse

Das aspirable Volumen von Knochenmark aus Oberschenkelknochen, Anzahl der Lebenden MNC aus dem Knochenmark gesammelt, Patientenalter, Anzahl der Lebenden MSCs bei Passage 3 nach der Expansion und DM-Tag, ein DM erfolgreichen Ausbau tragfähiger MSCs erreicht gerechnet gerechnet wurden zwischen DM proximalen verglichen (

4. Diskussion

4.1. Knochenmarksaspirationen und MSCs Charakterisierung

Knochenmark ist ein flexibles Gewebe im Inneren der Knochen. Im Durchschnitt Bildet Knochenmark 4% des Gesamten Körpermaße des Menschen. Das Knochenmark Bildet hämatopoetischen und lymphatischen Systeme. Knochenmark durchgeführt Werden Kann schwere Erkrankungen des Knochenmarks zu behandeln, einschließlich bestimmter Formen von Krebs Wie Leukämie [10]. Darüber hinaus können andere Linien unterschieden Werden und verwendet, um Krankheiten zu behandeln, [11] Knochenmarkstammzellen. Die Hinteren Beckenkamm ist eine leicht zugängliche Webseite für Knochenmarksaspiration sterben sicher ist [1]. Diagnostizieren, In der Regel für Biopsie und sterben klinische sterben sammeln Kliniker Knochenmark von Hinteren und Vorderen Beckenkamm und Lendenwirbel Stiels. Alternativ Kann Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen von Patienten, sterben Sich THA abgesaugt Werden TKA oder. Es gibt Berichte von Forschern Knochenmark von Patienten abgesaugt verwendung obwohl Standard OP-Protokoll 2 nie veröffentlicht [. 3 ]. Knochenmarksaspiration Elle Elle Verfahren von Patienten Können von Chirurg zu Chirurg variieren und Innerhalb von Sekunden zu Einer teilweisen oder Vollständigen Gerinnung von Knochenmark Führen Kann. Durch dieses der Elle Elle Verfahren Einführung Wird das Knochenmark direkt in sterben Probenfalle abgesaugt und das MIT-Antikoagulans in minimalen oder ohne Gerinnungs sofort resultierende Knochenmark (Figuren 1 (b) bis 1 (d)) gemischt Werd. Das Knochenmark Eine akzeptable Anzahl von multinationalen Unternehmen. Zweitens stellten wir EINEN SCHRITT des Filterns verdünnt Knochenmark Durch Weit gelochte Sieb JEDE faserige Gewebe oder kleines Stück Knochen in DM Knochenmark (Figur 1 (e)) zu entfernen. Die Knochenmarksaspiration von Patienten sterben Sich TKA und THA ist ein sehr Wirtschaftliches Elle Elle Verfahren. Knochenmark abgeleiteten MSCs Aus einer Standard-Biotechnologie-Unternehmen Einkauf können sehr teuer sein und 2. MSCs von Patienten Knochenmark isoliert konnten bei Passage auf 2.000 USD pro Million MSCs können Kosten bis trilineage Differenzierung (Adipogenese, Osteogenesis und Chondrogenese) zu unterziehen und zeigte Eine Spezifische positiv und negativ Zelloberflächenmarker (Abbildungen 2 -5) ähnlich wie früher berichtet BEREITS [12. 13]. Die Chondrogenese weiter im Details der untersucht Wurde (Abbildungen 6 bis 10).

Narbona-Carceles und Kollegen [14] aspiriert 5 ml Knochenmark aus Beckenkamm, distale Femur und proximale Tibia. In Unserem Elle Elle Verfahren aspiriert das Durchschnittliche Volumen von distalen Femur (während der TKA-Verfahren) Krieg ml; zusätzliche Gleiten Saugnadel in Markhöhle nicht zu Einer erhöhung der abgesaugten Volumen (Abbildung 1 (g)). Auf der anderen Seite, in proximalen Femur (während der THA-Verfahren) Würde der aspirierten Volumens ml Welche 2,29 mal Höher ist als am distalen Oberschenkel Krieg. Narbona-Carceles und Kollegen [14] berichtet Gewinnung von MNU pro ml Knochenmark Wie in distale Femur absaugen und in proximale Tibia aspiriert. Auf der anderen Seite Haben wir gezeigt, sterben MNU pro ml Knochenmark als und vom proximalen Femur und distalen Femur, BZW. (Figur 1 (f)). MNU Zahl Krieg Höher in Unserem Elle Elle Verfahren 18,46-fach in distale Femur-Gruppe als in punktierten Elle Elle Verfahren Knochen [14]. Dies Könnte auf den Grund zurückzuführen sein, Untersuchung Jüngeren Patienten in viel durchgeführt wir Dass. Narbona-Carceles und Kollegen [14] berichtet Gewinnung von MSCs (pro ml Lösung Ursprüngliche-Knochenmark) als

in distale Femur aspiriert und in proximale Tibia Aspiraten ein Tagen 40,1 und 40,7 auf Höhle. Auf der anderen Seite Haben wir gezeigt, sterben lebensfähigen MSCs (pro ml ursprünglichen Knochenmark) in proximale und distale Femur und als (Figur 1 (f)) and a den Tagen. Beziehungsweise. DAHER verglichen mit punktierten Knochen zur Elle Elle Verfahren distalen Femur [14], unser Elle Elle Verfahren Bereitgestellt 8,82-fach bildende höhere Anzahl lebensfähiger MSCs und das war am Tag, im Vergleich zu Knochen durchstochen Elle Elle Verfahren ein Tag 40,1 [14].

4.2. Micro Chondrogenese und Bewertung

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Mikromassen Knorpel aus dem Oberen Mittleren Bereich in Woche 4 gezeigt Sind (Figuren 10 (a) bis 10 (e)), STERBEN zeigten, dass Chondrozyten Sind normale und metabolisch Sind in der Natur. Zhang Labor zeigten gut entwickelte Golgi in Chondrozyten und Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix in Woche 3 der chondrogenen Kulturen [17]. In ähnlicher Weise wir gezeigt HaBen, gut entwickelte Golgi und Kollagenfasern in Mikromasse Knorpel (10 (b) und 10 (c)). Ichinose Labor zeigten rer- und reichlich Kollagenfasern in Tag-14-Pellet gut und gut entwickelte rer- und moderate Kollagenfasern in Mikromasse Knorpeln Entwickelt [31]. Umfangreiche rER ist in Woche 4 Erzeugt Micromass- Chondrozyten (Abbildung 10 (b)). Ultra Details von Mikromassen Knorpel zeigt viele Ähnlichkeiten Mit der Ultrastruktur von Menschlichen Gelenkknorpel [32. 33]. Chondrozyten aus menschlichem Gelenkknorpel Femur zeigt Vakuolen, Glykogen Ablagerungen und rER ähnlich zu den Strukturen, sterben wir in den Chondrozyten von Micro Knorpel Beobachtet [33]. Roy und Meachim bemerkt Glykogen Ablagerungen, viele Mitochondrien und Umfangreiche rER in Menschlichen nonfibrillated Femur Gelenkknorpels [32]. Lipidtröpfchen Sind in in vitro Chondrogenese von MSCs oder Chondrozyten [34. 35]. Wir beobachteten Lipidtröpfchen in Unserer Micro Knorpeln in Woche 4 (Figuren 10 (a). 10 (c). Und 10 (d)). Das Vorhandensein von Lipidtröpfchen ist kein Zeichen von Entartung betrachtet, da Lipidtröpfchen in Normalen Knorpel vorhanden Sind ,, ideal mit dem Altern erhöhen [36. 37] und sterben Genaue Rolle der Lipidtröpfchen ist noch nicht klar. TEM von Chondrozyten aus infrapatellar Fett gewonnenen Stammzellen abgeleitet zeigte Eine Reihe von Lipidtröpfchen [35].

5. Schlussfolgerung

Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren für sterben Aspiration von Knochenmark aus Würde DM Oberschenkelknochen von Patienten, Sich TKA oder THA etabliert sterben. Das Elle Elle Verfahren Stellt Eine kostengünstige Quelle von MSCs. Ein Vereinfachtes Elle Elle Verfahren Wurde beschrieben MSCs aus dem abgesaugten Knochenmark zu isolieren. MSCs gerechnet gerechnet wurden Auch Umfangreiche Charakterisierung Durch Chondrogenese aus. Die detaillierten SOPs wir zur verfügung Gestellt Werden Forscher und Kliniker helfen.

Bekanntgabe

Interessenkonflikt

Alle Autoren Haben nichts zu erklären.

Anerkennungen

Referenzen

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